描述：組織細(xì)胞總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（Cu²⁺法），即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with Copper Ion Method是一種靈敏簡(jiǎn)單的檢測(cè)總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，TAOC）的試劑盒。

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）主要包括羥基自由基、過氧化氫和超氧自由基。在細(xì)胞或組織的正常生理代謝過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧，同時(shí)一些環(huán)境因子例如紫外照射、γ射線照射、化學(xué)損傷、細(xì)菌病毒感染也可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。尤其是以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為代表的免疫細(xì)胞，在各種誘導(dǎo)條件活化后，產(chǎn)生大量活性氧?；钚匝醭龤≡w外，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白和DNA的損傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激（Oxidative stress），繼而導(dǎo)致各種原發(fā)性疾病的發(fā)生和加重各種繼發(fā)性疾病導(dǎo)致的機(jī)體損傷。

機(jī)體中存在多種抗氧化物，包括抗氧化大分子、酶和抗氧化小分子等，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的各種活性氧，以阻止活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激（Oxidative stress）的產(chǎn)生。一個(gè)體系內(nèi)的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總的水平體現(xiàn)了該體系內(nèi)的TAOC。因此，測(cè)定細(xì)胞、組織、血漿和其它各種體液中TAOC具有非常重要的意義。

原理：Cu²⁺法測(cè)定TAOC的原理是利用樣品中抗氧化物還原Cu²⁺為Cu⁺，Cu⁺與反應(yīng)體系中Cu²⁺螯合劑螯合，通過570nm吸光度可以測(cè)定Cu⁺產(chǎn)生量，從而測(cè)定樣品TAOC。利用具有強(qiáng)抗氧化能力的Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，可以計(jì)算樣品以Trolox為參照的TAOC。

本試劑盒方便快捷，加入待測(cè)樣品30分鐘即可進(jìn)行吸光度測(cè)定。并能利用蛋白沉淀試劑S沉淀蛋白后檢測(cè)樣品中小分子的抗氧化能力。

組成：（1）Cu+螯合劑溶液        25 ml/瓶      （2）Cu2+溶液    0.5 ml/管

           （3）10 mM Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液   0.5ml /管   （4）組織細(xì)胞裂解液  100ml

儲(chǔ)存條件：-20℃儲(chǔ)存，一年有效。

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀 最佳波長570nm

適用范圍：測(cè)定各類動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞、組織等。

操作步驟：

1. 樣品的準(zhǔn)備

1.1 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：收集新鮮細(xì)胞(如果是貼壁細(xì)胞，請(qǐng)用細(xì)胞刮刮下，不宜使用胰酶和EDTA消化)，PBS洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入200μl預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液，超聲破碎細(xì)胞釋放其中的抗氧化物。4℃，10000g離心10分鐘。取上清用于總抗氧化能力的測(cè)定。不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中總抗氧化能力超出測(cè)定范圍，可利用組織細(xì)胞裂解液適當(dāng)稀釋后測(cè)定，稀釋倍數(shù)請(qǐng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

 1.2 組織樣品的準(zhǔn)備：取20mg組織，加入400μl的預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液，用勻漿器冰浴勻漿。4℃，10000g離心10分鐘。取上清用于總抗氧化能力的測(cè)定。不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中總抗氧化能力超出測(cè)定范圍，可利用組織細(xì)胞裂解液適當(dāng)稀釋后測(cè)定，稀釋倍數(shù)請(qǐng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備

總抗氧化能力檢測(cè)工作液的配制：按下表比例取Cu⁺螯合劑溶液和Cu²⁺溶液配制總抗氧化能力檢測(cè)工作液。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

利用PBS將10mM的Trolox溶液稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031 mM濃度的Trolox溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。每次測(cè)定新鮮配制系列標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

4. 測(cè)定方法

4.1參考下表，使用96孔板，依次加入總抗氧化能力檢測(cè)工作液、樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后，混勻，室溫孵育30分鐘。

4.2 孵育結(jié)束后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定A_570nm。如果樣品吸光度過高，可適當(dāng)稀釋樣品后測(cè)定，如果樣品吸光度過低，可適當(dāng)冷凍干燥濃縮樣品后測(cè)定。

5. 數(shù)據(jù)處理

利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作Trolox抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式，然后利用標(biāo)曲和各樣品的吸光度值計(jì)算樣品的總抗氧化能力。

參考文獻(xiàn):

1. Valko, M. et al., 2006. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell.Bio., 39(1): 44-84.

2. Sies, H., 1997. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Exp. Physiol., 82(2): 291-295.

注意事項(xiàng):

1. 本試劑盒檢測(cè)涉及氧化還原反應(yīng)，很多氧化劑和還原劑都會(huì)干擾試劑盒的測(cè)定，特別是巰基乙醇、DTT等含有巰基的試劑會(huì)嚴(yán)重干擾本試劑盒的測(cè)定，請(qǐng)盡量避免。

2.每次測(cè)定同時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 初次使用試劑盒時(shí)，粉末試劑和小體積液體試劑請(qǐng)適當(dāng)離心后使用。

4. 本產(chǎn)品僅限專業(yè)人員用于科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

     5. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。