HPLC檢測平臺

高效液相色譜（High-performance liquid chromatography, HPLC） 是一種色譜分析技術(shù)，色譜法的分離原理是：溶于流動相（mobile phase）中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相（stationary phase）發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，依賴于泵加壓后色譜柱中填充物對于樣品中各組分吸附力的不同，從而實現(xiàn)各組分快速的分離，先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法（Chromatography）因之得名。HPLC可以實現(xiàn)絕大部分物質(zhì)的分離鑒定。液相色譜的誕生，源于氣相色譜對于高沸點有機物分析，如蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)的局限性。自1980年代，隨著適用于分離蛋白質(zhì)和其它生物大分子的色譜柱進入市場以來，HPLC開拓了它在生物化學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。HPLC是目前應(yīng)用最廣的分析技術(shù)，質(zhì)譜作為分離技術(shù)與HPLC競爭的同時又可以在多方面互補使用，如LC-MS。上海極威生物科技有限公司檢測平臺使用高效液相色譜的方法，可實現(xiàn)對樣品進行鑒定，可高效、精準(zhǔn)的進行定量分析。

HPLC分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質(zhì)，表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留時間不同，從而實現(xiàn)分離。

極威生物小知識：

PBS保存方法

    加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L。高溫高壓滅菌后置于4攝氏度冰箱保存待用。

    PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L， KH2PO4 2mmol/L

    PBS緩沖液一般作為溶劑，起溶解保護試劑的作用，具體試劑一般也有不同的比例配方，在針對性上就有了更好的效果。

    1x PBS緩沖液就是0.01M的PBS,可直接使用,2x PBS就是2倍濃度,使用時稀釋一倍使用。0.1M的PBS一般不用來配置緩沖液,用于其它用處。

高效液相色譜常用檢測器

(1)紫外可見分光檢測器(UVD)。
(2)雙光路雙流路紫外/熒光檢測器(UV/FLD-1)。
(3)蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)。
(4)液相色譜-液相色譜聯(lián)用(HPLC-HPLC)。

HPLC檢測原理圖

高效液相色譜法的特點和優(yōu)點

HPLC有以下特點：

高壓：壓力可達150～300Kg/cm 2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm 2以上。

高速：流速為0.1～10.0 ml/min。

高效：可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度：紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

應(yīng)用范圍廣：70%以上的有機化合物可用高效液相色譜法分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物；

HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：

速度快：通常分析一個樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。

分離效率高：可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍；

靈敏度高：紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg。

柱子可反復(fù)使用：能同時分離多種物質(zhì)，用一根色譜柱可分離不同的化合物，能同時分離的成份可達100種；

樣品量少，容易回收：進樣量在μL數(shù)量級，而且樣品經(jīng)過色譜柱后不會被破壞，可以收集單一組分或做制備。

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