【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬痢疾蛇形螺旋體(SH)熒光PCR檢測(cè)試劑盒

Name ：Real-Time PCR Method

【包裝規(guī)格】48T/盒

豬痢疾蛇形螺旋體(SH)熒光PCR檢測(cè)試劑盒【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測(cè)標(biāo)本中指標(biāo)的定量檢測(cè)，輔助診斷。

【試劑組成】

名 稱	規(guī) 格
酶液	50μL×1 管
反應(yīng)液	1.0mL×1 管
陽(yáng)性質(zhì)控品	50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品	250μL ×1 管
核酸提取液	1.5ml×2管

詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)

注：

1） 不同批號(hào)試劑不能混用。

2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對(duì)指標(biāo)特異核酸序列設(shè)計(jì)引物和探針，用一步法熒光RT-PCR 技術(shù)對(duì)指標(biāo) RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

【標(biāo)本采集】

咽拭子：應(yīng)使用與用采樣拭子，適度拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌 部 ； 迅 速 將 拭 子 放 入 標(biāo) 本 采 集 管 中 ， 旋 緊 管 蓋 并 密 封 ， 以 防 干 燥 。

全血：疑似感染病人的靜脈血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管，8000rpm 離心 2min，取適量上清液于 1.5mL 滅菌離心管中。痰： 以清晨的 口痰為宜。先用清水漱口，囑患者用力咳出深部的痰于無(wú)菌樣本保存管，密封，即可送檢。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但丌能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

1.2DNA 提取

1) 對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2 RNA 提取

推薦采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑	反應(yīng)液	酶液
用量	20μL	1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道

（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟	循環(huán)數(shù)	溫度	時(shí)間	收集熒光信號(hào)
1	1 cycle	42℃	20min	否
2	1 cycle	95℃	10min	否
3	40 cycles	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

豬痢疾蛇形螺旋體(SH)熒光PCR檢測(cè)試劑盒【注意事項(xiàng)】

① 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

②試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；

③反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

④反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

⑤使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

⑥樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

⑦實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

⑧試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且有明顯的擴(kuò)增曲線。

可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線則為陽(yáng)性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú) Ct 值且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線且無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7. 檢測(cè)方法的局限性

① 樣本檢測(cè)結(jié)果不樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

②樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

③陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

④病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

⑤不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

⑥試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺動(dòng)物，取水泡皮及水泡液；待檢活動(dòng)物，取 O/P 液 2~3mL。<